新冠病毒（SARS-CoV-2）检测技术简要盘点（2.三种核酸检测方式）

全球新冠疫情现状仍然十分严峻，在研制出有效疫苗药物之前，病毒检测仍将是抗击疫情中一大重要环节。核酸检测是我们经常听到的一种主流检测手段，相信读者们对其检测原理与优缺点都有一定的思考。本文为相关论文业余综述的第二部分（第一部分链接留请参见最后拓展部分），旨在继续介绍检测手段中核酸检测这一方法，并对其中三大方法进行进一步解释，为有相关疑惑的读者提供一些思路。

声明

本文源于笔者2019-2020春季学期生物课大作业，本人非生物专业，发表本文旨在于为对病毒检测技术有最初等了解必要的读者提供个人整理的业余文献综述。

本文仅供参考，与事实不符之处请以专业文献为准，本人知识无情的文献整理搬运机器：|。

若本文有任何不严谨或纰漏之处，望各位dl不吝赐教。

手段2：核酸检测

核酸检测技术通过扩增目的序列（特定的病毒基因序列），最终检测扩增样品中目的序列的含量，从而判定原样品中的目的序列含量以及患者是否患病。目前市面最为常用的核酸检测试剂主要采用实时荧光RT-PCR核酸检测技术，而LAMP（环介导等温扩增）技术与RPA（重组酶聚合酶扩增）技术也有成为主流检测技术的潜力。

手段2.1：实时荧光RT-PCR（反转录·聚合酶链式反应）

• 原理

实时荧光RT-PCR核酸检测技术是建立在普通PCR技术基础上的。

PCR技术是最常见的扩增目标核酸片段的方法之一，包括变性、退火、延伸三步骤：

1. 变性阶段通过升高体系温度使DNA双链分离；
2. 退火阶段通过降温使原先被一同加入体系的、能与目标片段两端互补的引物与单链DNA结合；
3. 延伸阶段体系中的DNA聚合酶从引物结合部位开始沿DNA链形成互补链，从而完成片段的复制，该阶段温度取决于所用DNA聚合酶的最适温度。

普通PCR技术能够扩增目的基因片段，但具有分离处理步骤繁琐、不能准确定量、扩增时打开体系易引入污染等缺点。

而实时荧光PCR技术则具有能够定量测量、操作便捷、快速高效、特异性强、污染风险小等优势，因而被广泛应用于核酸扩增等各种领域。

荧光定量PCR技术在反应中加入荧光染料物质，使PCR的扩增过程能够用荧光信号强度得到反映。

以最常用的TaqMan探针染料为例，原理如图3所示。

TaqMan探针染料包括两部分，一部分为5端的荧光基团R，另一部分为3端的猝灭基团Q，该探针能与目的序列特异性杂交。

在PCR过程中所用到的Taq酶在延伸阶段复制DNA的同时，会将与特异片段结合的探针切割，从而使荧光基团R与猝灭基团Q分离。

在探针被切割前，由于P、Q基团靠近，故不发出荧光；

而当探针被切割，P、Q基团分离后，荧光基团P将发出荧光，代表目的序列完成一次DNA的复制。

如此一来，体系荧光强度便与目的片段的扩增次数成正相关。

样品中原有目的片段含量越低，达到一定扩增量，即达到一定荧光强度所需的PCR循环次数越大。则通过测量体系荧光强度到达设定阈值所需的循环次数（即Ct值），便可反映原样品中目标片段的含量[3]。

由于SARS-CoV-2病毒的遗传物质为RNA，故荧光定量RT-PCR技术，在荧光PCR之前，还需再进行一次RNA逆转录，使样品中的RNA链逆转录形成互补的DNA链，之后再进行荧光定量PCR，通过测量Ct值大小实现片段扩增过程中的定量检测，从而反映样品中的病毒RNA含量。

常用的扩增靶基因有ORF1ab、S、N、E等基因[3]。

• 优缺点

实时荧光RT-PCR技术的优点，在于它克服了普通PCR技术需对产物后续处理，无法定量的缺陷，较大程度上实现了核酸检测的便捷化、高效化。

故实时荧光RT-PCR技术成为了目前官方使用的SARS-CoV-2确诊方法。

但该技术仍有其不足之处。如需要能够精密控温的仪器，反应时间在4～8小时，过程仍然耗时较长，对实验操作要求高、成本较高等等。

由此一来，对仪器要求较低、无需升降温的扩增方法便具有替代实时荧光RT-PCR技术成为主流检测技术的潜力。

手段2.2：LAMP（环介导等温扩增）

• 原理

环介导等温扩增技术（LAMP）即是一种可在60～65˚C恒温条件下、15～60分钟内实现${10}^9$10^9到${10}^{10}$10^{10}倍扩增，且操作简单、终点检测可视的核酸扩增技术。且该技术已成功应用于SARS冠状病毒、HIV等多种病原体检测中。

LAMP技术针对目的片段的6个区域设计4种特异性引物：

1. F3（上游外部引物）
2. B3（下游外部引物）
3. FIP（上游内部引物）
4. BIP（下游外部引物）

在嗜热脂肪芽孢杆菌链置换 DNA 聚合酶（Bst DNA polymerase） 的作用下，可实现目标片段的扩增。

LAMP等温扩增的具体过程为（更直观的视频演示可参见【环介导等温扩增】原理动画）：

1. FIP与目的片段上游结合，目的片段上游被部分解旋，如图4-(2)所示；
2. 在DNA聚合酶作用下FIP片段向下游延伸，占据原目的片段中的一条互补单链，如图4-(3)所示；
3. F3与目的片段上游结合，如图4-4所示；
4. 在DNA聚合酶作用下F3片段向下游延伸，原先FIP为起点的延伸片段脱离，同时由于该延伸片段上游F1与F1c互补，形成自交环结构，如图4-(5～7)所示；
5. 下游部分同上述操作，形成上下游均为自交环状结构的目的片段，并以此作为扩增起始片段，如图4-(8)所示；
6. 该上下游均有自交环状结构的扩增起始片段具有多个起始位点，扩增将在多位点启动并形成多联体，如图4-(9)所示。

最终产物可用多种方式进行可视检测。

以利用浑浊度作为反映指标为例，其原理为：DNA合成时，从脱氧核糖核酸三磷酸底物（dNTPs）中析出产生大量焦磷酸，会产生明显的pH变化，可与反应体系中的$M{g}^{2+}$Mg^{2+}离子反应，生成呈白色浑浊的焦磷酸镁沉淀，以浑浊度作为指标，可定量检测且可视[3]。

• 优缺点

同于PCR技术，LAMP技术能不经过逆转录，直接应用于RNA片段的扩增，故相比于前一技术，可减少一步骤，进一步缩短检测时间。

LAMP技术具有较高的灵敏度、较快的反应速率和极强的特异性，且能在恒温条件下扩增，检测可视，操作简单，这些都是LAMP技术相比于实时荧光RT-PCR技术所具有的优势。

但另一方面，LAMP技术的引物设计环节十分复杂，极易产生非特异性扩增，故开发过程相对复杂，不利于早期的试剂量产，这些均为LAMP技术的不足之处，但不足以抹杀其成为新型检测技术的潜力。

手段2.3：RPA（重组酶聚合酶扩增）

• 原理

重组内聚合酶扩增技术（RPA）是一种核酸等温扩增技术，可在37～42˚C的条件下，在40～60min内完成${10}^9$10^9倍的扩增。且产物可以通过实时荧光检测方法（real-time-RPA）等方法进行检测[3]。

RPA技术原理如图5所示。

RPA技术中，三种最重要的物质为：

1. 重组酶uvsX，用于协助单链引物与双链DNA目标区域的结合；
2. 单链结合蛋白Gp32，在重组酶uvsX协助引物结合到一条目标单链上后，进一步与游离的目标单链片段互补片段结合，使其保持稳定而不妨碍整个扩增过程；
3. 链置换DNA聚合酶Bsu，与一般DNA聚合酶作用相同，负责协助与目标片段结合的引物的进一步扩增。

与PCR技术相比，重组酶uvsX与单链结合蛋白Gp32的作用类似PCR中的变性与退火，链置换DNA聚合酶Bsu的作用则与PCR中的延伸阶段类似。

但在RPA技术中DNA双链的解旋和引物的结合不再依靠温度变化，而是直接依靠生物大分子的协助。

如前所述，RPA扩增产物的检测，也可依靠实时荧光检测方法定量检测。而检测原理也与荧光定量PCR类似，利用荧光基团和荧光猝灭基团组成的荧光探针以及一种特殊的核酸内切酶Nfo（大肠杆菌核酸内切酶IV）。

当扩增到指定片段时，核酸内切酶将破坏荧光探针中连接荧光基团和荧光猝灭基团的化学结构，从而使两基团分离，发出荧光。利用荧光强度与扩增次数的正相关关系，即可定量检测扩增情况。

• 优缺点

相比于PCR技术，RPA与LAMP技术类似，具有反应快速、反应条件恒温、目标片段既可为DNA，也可以为RNA。同时相比于LAMP技术，RPA技术所需引物数量仅为2，比LAMP的4引物要小，探针引物设计方面相比其他等温扩增技术更为简单，同时所需温度比LAMP更低，进一步降低实验成本和耗时。

RPA技术也有其缺陷。如模板浓度较低时由于没有PCR技术中的控温步骤，引物之间的结合所产生的非特定信号将影响实验结果，同时引物自身的结合也将降低反应速率。再如在利用琼脂糖凝胶电泳检测产物时，产物需要纯化从而降低检测效率。

但RPA技术的潜力仍不容小觑。RPA技术现已应用于多种快速现场检测的场合，如HIV等病毒和结核杆菌等致病菌的检测，且相比传统方法效果更佳、效率更高。

RPA作为一种新型的等温核酸扩增技术，RPA应用于新冠肺炎病毒的核酸检测有其可行性。

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拓展

本综述的其他部分见下：